问题详情：
荧光蛋白（GFP）在紫外光下会发出绿*荧光，某科研团队将GFP基因*入质粒P中构建了重组质粒载体P0，用于基因工程中基因表达载体（P1）的筛选和鉴定。部分过程如下图所示，下表为部分限制酶的识别序列及切割位点。回答问题：
（1）过程①中用EcoRV酶切获得的目的基因具有_________末端，过程②表示利用PCR技术扩增目的基因，前提是要根据_________设计出引物，此外还需在引物的一端加上_________序列，以便于P1的构建和筛选。
（2）过程③中，质粒P0需用限制酶_________切割，才能与扩增出的目的基因在_________酶作用下形成P1。
（3）为了筛选出含有质粒P1的菌落，需采用添加_________的培养基平板进行培养，在紫外光激发下_________的菌落，即为含有P1的菌落。
（4）提取经上述筛选所得菌落的RNA，通过_________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出目的基因，可能的原因是__________。
【回答】
平 一段已知目的基因的核苷*序列 GATC BamHⅠ DNA连接 四环素 不发出绿*荧光 逆转录（反转录） 目的基因未能在受体菌中转录
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因*法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注*法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染*体的DNA是否*入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活*鉴定等。
【详解】
（1）从表格中看出用EcoRV酶切获得的目的基因具有平末端；PCR扩增目的基因，需要根据一段已知目的基因的核苷*序列设计出引物；构建P1时，限制酶Sau3AⅠ会破坏四环素抗*基因（标记基因），所以只能选择BamHⅠ，还需要在引物的一端加上GATC序列。
（2）根据（1）的分析，限制酶Sau3AⅠ会破坏四环素抗*基因（标记基因），而EcoRV酶破坏复制原点，所以需要用择BamHⅠ酶进行切割，切割后的目的基因在连接酶的作用下形成P1。
（3）为了筛选含有质粒P1的菌落，由于标记基因是四环素抗*基因，所以需采用添加了四环素的培养基平板进行培养在紫外光激发下，由于使用BamHⅠ酶破坏了GFP基因，所以选择不发绿*荧光的菌落，即为含有P1的菌落。
（4）所得菌落的RNA通过逆转录（反转录）获得DNA，再进行PCR扩增；若最终未能检测出目的基因，可能的原因是目的基因未能在受体菌中转录。
【点睛】
本题考查基因工程的基本步骤，难点是根据质粒的结构选择合适的限制酶。识记运载体的特点即可解答。
知识点：基因工程
题型：综合题
